长链非编码RNA 在食管鳞癌中的功能及临床应用价值(独家原创)

摘要: 食管癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,死亡率位居我国恶性肿瘤第4 位。食管癌主要有2 种病理类型:食管腺癌与食管鳞状细胞癌,在我国多为食管鳞癌。目前关于食管鳞癌的病理机制尚未完全明确。

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长链非编码RNA 在食管鳞癌中的功能及临床应用价值

王源舒,王颖,林辰雨,徐寒梅*

( 中国药科大学多肽药物创制工程研究中心,江苏 南京 211198)

[ 摘要] 食管癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,死亡率位居我国恶性肿瘤第4 位。食管癌主要有2 种病理类型:食管腺癌与食管鳞状细胞癌,在我国多为食管鳞癌。目前关于食管鳞癌的病理机制尚未完全明确。长链非编码RNA(lncRNA)是指长度大于200个碱基的无编码蛋白能力的RNA。研究发现lncRNA 可以在多个水平参与基因表达调控,进而影响食管鳞癌发生发展及重要生物学过程。通过归纳总结lncRNA 在食管鳞癌中病理机制的文献报道,以期为将lncRNA 开发成食管鳞癌的新型诊断标记物以及作为治疗靶点进行药物研发提供重要参考。

[ 关键词] 食管鳞癌;长链非编码RNA;临床应用

 

食管癌(esophagealcarcinoma)是人类最常见的恶性肿瘤之一,死亡率居我国恶性肿瘤第4 位。我国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家,占全球发病人数的49.0% 。食管癌主要包括2 种病理类型:食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinomaESCC)与食管腺癌(esophagealadenocarcinomaEAC)。我国及绝大多数的东亚地区以食管鳞癌为主,而西方国家则以食管腺癌为主。

目前,ESCC的常规治疗手段主要包括外科手术切除、化疗和放疗,然而这些治疗方案的结果却往往不尽如人意。这是由于食管癌发病的隐匿性较强,早期症状不典型,大多数患者确诊时已处于中晚期,患者的5年生存率不超过20% 。因此,寻找新的临床诊断标志物,提高ESCC 早期诊断率,对ESCC 防治极其重要。

近期研究发现,作为人类基因组中的重要组成部分的长链非编码RNAlong non-coding RNAlncRNA)在ESCC 中存在着异常表达,而且广泛参与了ESCC 发生发展病理过程中的基因表达调控。本文通过归纳总结近几年lncRNA ESCC中病理机制的相关文献报道,以期对其作为ESCC 临床诊断标记物以及治疗靶点的研发提供参考。

1lncRNA 的生物学特性及分类

lncRNA 是指长度大于200 个碱基(nt)、无编码蛋白能力的RNA。人类全基因组测序结果显示,具有编码蛋白质功能的基因只占全基因组的1.0%~2.0%98% 以上的基因组区域不编码产生蛋白质,但会转录生成非编码RNAnon-coding RNAncRNA)。

ncRNA 根据其核苷酸的长度主要分为2 类:①短链ncRNA,其中包括miRNA19~24 nt)、piRNA26~31nt)与siRNA21~25 nt);②以及长度大于200 nt lncRNAlncRNA RNA 聚合酶转录合成,无蛋白质编码功能,但具有类似于mRNA 5′ 端帽子、3′ Poly A 尾结构以及选择性剪接现象。lncRNA 根据其基因的染色体定位,可以分为以下5 类:①同义(senselncRNA:此类lncRNA 的基因区与蛋白编码基因处于同一链上(正义链),且与一个或多个蛋白编码基因的外显子区域重叠;②反义(antisenselncRNAlncRNA 转录自蛋白编码基因的互补链(反义链);③双向(bidirectionallncRNA:指以蛋白编码基因的正义链为模板,但由3′ 端向5′ 端反向转录的lncRNA,这类lncRNA 的转录起始位点与其相邻蛋白编码基因的十分接近;④内含子(introniclncRNA:此类lncRNA 转录自某个蛋白编码基因的一个内含子区域,其序列与外显子无任何重叠;⑤基因间(intergeniclncRNA:又称为lincRNA,其基因区位于相邻2 个蛋白编码基因之间的间隔区。

2lncRNA 参与食管鳞癌的基因调控

2.1lncRNA 的顺式调控

lncRNA 可以直接影响其基因区邻近部位的蛋白编码基因的表达,这种lncRNA 对编码基因的调控作用称为顺式调控。细胞周期蛋白激酶抑制因子反义非编码RNAantisense non-coding RNA in theinhibitor ofcyclin-dependent kinase locusANRIL)转录本长度为3 834 bpChen 研究发现,ANRILESCC 组织中表达上调,抑制ANRIL 表达可增加转化生长因子b1TGFb1)的表达量,并通过Smad2Smad3 激活细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子4BINK4B)表达,引起ATM 依赖的DNA 损伤,最终抑制细胞增殖,说明ANRIL 通过TGFb1 信号通路调控ESCC 发生发展。

ZEB1 基因(Zinc finger E-box-binding homeobox1E 盒结合锌指蛋白编码基因)反义链转录的lncRNAZEB1-AS1,位于10p11.22 染色体。在ESCC 癌组织中,ZEB1-AS1 表达量显著上调,且其表达水平与肿瘤分级、浸润深度及淋巴结转移有关,其高表达患者的预后较差。研究发现,ZEB1-AS1 序列可与ZEB1 基因发生互补配对,并直接与ZEB1 启动子区域结合并募集组蛋白乙酰转移酶p300 于该位点,诱导ZEB1 染色体结构舒展,激活ZEB1 转录。

2.2lncRNA 的反式调控

反式调控是指lncRNA 与蛋白复合物结合并定位到靶基因上,远距离作用于其他染色体上的基因,这使得lncRNA 可以像蛋白因子一样,在大范围的基因网络中发挥调控作用。

lncRNA HOTAIR 是在人成纤维细胞的HOX 基因(homeotic genes)中首次发现的通过反式调控基因表达的lncRNA HOTAIR 位于12q13.13 染色体, 由HOX 基因反义链转录,长度为2.2 kb。多项研究发现,HOTAIR ESCC 组织中表达量升高,而且这种表达水平的升高和食管癌远端转移和组织分化显著相关。Ge 研究发现,HOTAIR ESCC 中可以促进WIF-1wnt inhibitory factor-1)启动子区域的组蛋白H3K27 的甲基化,抑制WIF-1 基因的表达,激活Wnt/β-catenin 通路。

2.3lncRNA 参与基因转录后的选择性剪接

基因转录后会产生mRNA 前体(pre-mRNA),pre-mRNA 通过剪接将蛋白质编码区相连,不同的剪接方式产生不同的mRNA 剪接异构体,最终编码出的蛋白产物也会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性,mRNA 的这种转录后加工过程称为选择性剪接。

lincRNA-uc002yug.2 被发现在ESCC 组织中高表达,且与ESCC 患者的不良预后相关。研究发现,lincRNA-uc002yug.2 RUNX1runt-related transcriptionfactor 1)基因pre-mRNA 内含子区域有一段277 nt 的互补序列,可以在转录后水平调控RUNX1 基因premRNA的选择性剪接, 使其产生更多的RUNX1aCEBPα 基因(CCAAT/enhancer-binding protein-α) 可以阻断细胞增殖,RUNX1a 存在可以抑制CEBPα 基因表达, 促进ESCC 发展。该研究揭示了lincRNAuc002yug.2 参与ESCC 发展的重要分子机制,及其成为ESCC 预后标志物的可能性。

2.4lncRNA 作为ceRNAs 发挥调控作用

miRNA 常常通过识别并结合靶基因转录出的mRNA,诱导mRNA 降解或抑制其翻译过程,在转录或转录后调控靶基因表达。有些lncRNA 通过与mRNA 竞争性地结合miRNA,调控mRNA 的水平,这种lncRNA 被称作竞争性内源RNAcompetingendogenous RNAsceRNA)。

SOX2 基因是一个重要的多功能性调控基因,其基因区与SOX2OTSOX2 overlapping transcript)的第3个内含子序列重合。Shahryari 发现SOX2OT 2个可变剪接体SOX2OT-S1 SOX2OT-S2 均在ESCC 表达上调,并通过阻滞细胞周期于亚G1 期(sub-G1),影响ESCC 的发生发展。Shafiee 通过生物信息学分析及实验证明,miR-211 有与SOX2OT SOX2 转录本互补的序列。miR-211 可与SOX2 结合并抑制SOX2表达,而SOX2OT 通过与SOX2 竞争性结合miR-211,解除miR-211 SOX2 表达抑制。

Ren 研究发现,HOTAIR 作为ceRNAs 可以通过与miR-1 直接结合,下调miR-1 表达量,解除miR-1 对靶蛋白细胞周期素D1cyclin D1CCND1)的抑制作用,从而影响细胞周期,促进ESCC 细胞增殖。

lncRNA BC032469 被发现在ESCC 中高表达 ,并与患者淋巴结转移及总生存率降低相关。研究发现BC032469 可以调控人类端粒逆转录酶hTERT 基因,过表达BC032469 上调hTERT蛋白水平,促进细胞增殖、迁移及侵袭,从而影响ESCC 进程。研究发现,BC032469 序列上存在miR-1207-5p 结合位点,并通过与其下游靶基因hTERT 竞争性结合miR-1207-5p,进而调控hTERT 的表达。

2.5lncRNA 间的相互调节作用

肝细胞核因子1 同源异形框A- 反义RNA1hepatocyte nuclear factor 1 homeoboxA-antisense RNA 1HNF1A-AS1),全长2 455 bp,位于染色体12q24.31上。Yang 发现HNF1A-AS1 在原发性EAC 中明显高表达,进一步研究发现,敲低HNF1A-AS1 表达后,lncRNA H19 表达抑制被解除,说明HNF1A-AS1 可能通过刺激lncRNA H19 的表达,调控染色质和核小体组装从而参与EAC 的发生。该项研究提示lncRNA 发挥作用的方式多种多样,某些lncRNA 可通过作用于其他lncRNA 从而调控肿瘤的发生发展,这为揭示lncRNA参与肿瘤调控的分子机制提供了新的思路和方法。

3lncRNA 与食管鳞癌的家族遗传性

包括ESCC 在内的所有人类癌症的发生发展都伴随着一系列的遗传变异。研究发现在我国食管癌的高、低发区均存在食管癌家族聚集现象,且男性中食管癌的发病和死亡例数是女性的2 倍以上。研究者们普遍认为,ESCC 的发生发展归因于遗传易感性、环境因素以及基因与环境因子的相互作用。Zhang 通过研究HOTAIR 的功能性单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphismsSNP)对ESCC 的影响,发现HOTAIR的表达量受等位基因特异性调节,Rs9200778 SNP位点,TT 指该位点上DNA 碱基为TTCC 则表示该位点的等位基因是CC 碱基, HOTAIR Rs920778 TT 基因型携带者比Rs920778 CC 具有更高的患癌风险。同时,他们在HOTAIR 内含子区域发现了一种新的HOTAIR增强子,Rs920778 通过该增强子对HOTAIR 的表达量进行等位基因特异性调节。在ESCC 细胞系及正常食管组织样本中发现,Rs920778 TT 基因型携带者中HOTAIR 表达量更高。这项研究证明了ESCC 的家族遗传性及其与lncRNA 的相关性。

4lncRNA 在食管鳞癌诊疗中的应用前景

4.1lncRNA 与肿瘤诊断

ESCC 具有发病隐匿性强的特点,大多数的ESCC患者在确诊时已处于癌症中晚期。现有的ESCC 检测手段主要包括:磁共振成像、计算机断层扫描、X 射线、超声波、组织病理学、分子病理学以及循环肿瘤细胞检测等,这些手段虽然准确性较高,但价格昂贵且具有侵入性,不适合应用于ESCC 的早期筛查。近年来,在ESCC 患者血液检测到lncRNA 的报道越来越多,其应用于ESCC 诊断有检测方法简单快速、无侵入性等优点,对ESCC 的早期筛查有重大意义。

例如,linc-POU3F3 位于2q12 染色体POU3F3classIII POU family of transcription factors)基因上游4 kb 的反义链上。其转录本长度为608 bp,包含一段在哺乳动物中高度保守的序列。linc-POU3F3 ESCC 癌组织中表达量显著高于正常组织。POU3F3 基因编码产物是一种转录因子,在肿瘤组织中,POU3F3 基因高度甲基化,转录活性受抑制,linc-POU3F3 可以通过EZH2 蛋白,介导DNA 甲基转移酶(DNA methyl-transferaseDNMT)与POU3F3 基因的结合,促进POU3F3 基因的甲基化,降低POU3F3 转录活性,从而促进ESCC的发展。Tong 研究发现linc-POU3F3 ESCC患者血液中的表达水平也显著高于正常人群。结合ESCC 患者病理学特征分析,发现linc-POU3F3 可用于ESCC 的诊断,且相比于传统诊断指标,其准确性更高。进一步发现,linc-POU3F3 与传统指标联用,可作为ESCC 初期筛查的指标,有效诊断早期阶段的ESCCHu 发现一种三元lncRNA 标志物(linc-POU3F3linc00152 CFLAR-AS1),其在健康者、食管异常增生患者及ESCC 患者的血液中的表达量逐步提高。ROC 分析证明该三元lncRNA 标志物可以作为ESCC的快速早期诊断指标且准确性高于传统指标。此外,结合ESCC 患者的5 年生存期分析,发现血液中该指标的高表达与患者不良预后相关。

BRAF 基因激活非编码RNABRAF activated noncodingRNABANCR),是一个长度为688 bp 的转录本,曾在黑色素瘤中被报道。Liu 检测了142 ESCC 组织和癌旁组织样本,发现在癌组织及细胞系中BANCR 的表达上调,Kaplan-Meier 生存曲线分析显示,BANCR 高表达患者的总生存率小于低表达患者,且病理分级更高、淋巴结转移范围更广。进一步检测血浆中BANCR 的表达水平,发现BANCR ESCC 患者血浆中的表达水平也显著高于正常人,且经过外科手术清除癌变组织后患者血液中BANCR 表达水平恢复正常。此外,在正常食管上皮组织、轻度食管上皮内瘤变(LGESIN)组织及高度食管上皮内瘤变(HGESIN)组织中,BANCR 的表达水平随着组织病变程度的加重而升高。此项研究提示,BANCR 对于LGESIN 患者及早期ESCC 患者的诊断有重要的意义及开发价值。

4.2lncRNA 与肿瘤预后

Guo 发现LOC100130476 ESCC 组织及细胞系中表达显著下调,且上调LOC100130476 表达可抑制细胞增殖与浸润能力。进一步研究发现,在癌组织中,LOC100130476 的转录起始位置发生高度甲基化,导致该基因转录沉默。LOC100130476 的高度甲基化与临床病理分期相关。Ⅲ期及Ⅳ期ESCC 患者中,LOC100130476 低表达或基因高度甲基化者,生存期更短。

Zhao 检测了70 ESCC 患者的癌及癌旁正常组织,发现BC200 在癌组织中高表达,Kaplan-Meier生存分析显示,BC200 高表达患者的无病生存期及总生存期短于低表达患者,BC200 高表达的患者预后情况较差。该研究结果表明,BC200 可作为ESCC 患者的预后标志物。

PlncRNA-1prostate cancer non-coding RNA 1)长度为12 722 bp,位于8q24.2 染色体。Wang 研究了73 ESCC 患者癌和癌旁组织中的表达情况,发现PlncRNA-1 ESCC 组织中高表达,且与病理分期、淋巴结转移显著相关,体外实验中,敲低PlncRNA-1 可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。

肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA 1actinfilament associated protein 1-antisenseRNA 1AFAP1-AS1),位于人类染色体4p16.1 上,全长6 810 bp,是从AFAP1 基因的反义链转录产生的lncRNAAFAP1-AS1 ESCC 组织中表达上调,且其表达量与TNM 分期晚期及肿瘤体积呈正相关。敲低AFAP1-AS1 后,能有效抑制细胞增殖、克隆形成并诱导细胞凋亡。Zhou 发现AFAP1-AS1 高表达与淋巴结远端转移,临床晚期及放化疗耐受显著相关。Kaplan-Meier 生存曲线分析显示,AFAP1-AS1 高表达患者的无进展生存期(PFS)及总生存期(OS)更短。研究表明AFAP1-AS1 高表达可以成为预测患者生存的生物标志物,从而有可能成为ESCC 治疗的潜在分子靶标。

RP11-766N7.4 ESCC 患者癌组织中表达下调,且与淋巴结转移,肿瘤分期及患者生存率相关。在ESCC 细胞系中抑制RP11-766N7.4 的表达可以诱导EMT 过程,促进细胞迁移与侵袭,证明RP11-766N7.4是一个肿瘤发生和转移的抑制因子。

lncRNA SPRY4-IT1SPRY4 intronic transcript 1)是长为703 bp 的转录本,位于人类染色体5q31.3 上。转录自SPRY4sprout homolog 4) 基因上第2 个内含子区域,研究发现高表达SPRY4-IT1 能促进黑色素瘤的发展。Xie 研究了92 ESCC 患者与8 ESCC 细胞系中SPRY4-IT1 的表达情况,发现在ESCC患者癌组织与细胞系中,SPRY4-IT1 表达量显著高于正常组织与正常食管上皮细胞。SPRY4-IT1 高表达患者的总生存期更低、预后状况差,多变量分析结果显示SPRY4-IT1 可作为一个独立的预后标志物。此后,多项研究报道,SPRY4-IT1 的高表达与ESCC 分级、深度浸润、淋巴结转移显著性相关。体外实验发现,SPRY4-IT1 可激活ZNF703zinc finger protein 703)的表达,增强细胞增殖能力。过表达SPRY4-IT1 可以提高Vimentin Fibronectin 表达量,并抑制E-cadherinZO-1 表达, 说明SPRY4-IT1 可以通过诱导EMTepithelial-mesenchymal transition), 提高ESCC 细胞运动性;同时,敲低SPRY4-IT1 后,可以显著减弱TFG-β 诱导的EMTSPRY4-IT1 可以直接增加EMT的核心转录因子Snail 的转录、表达与细胞核定位,且SPRY4-IT1 诱导的EMT 作用需通过Snail 介导。

4.3lncRNA 在食管鳞癌患者放化疗耐受中的作用

放射治疗是ESCC 的主要治疗方式,然而大多数患者从放疗中获益甚少,究其原因是因为放疗耐受。放疗抵抗是癌症治疗失败的原因之一,目前针对该问题还没有太好的解决方法,lncRNA 参与癌症放疗抗性的研究将有望使其在癌症抗性治疗中成为新的分子靶标。

BOK 基因反义RNA1BOK antisense RNA 1BOKAS),位于2q37.3 染色体,全长849 bpWnt/β-catenin 信号通路对细胞生长、分化及存活有促进作用,Wnt/β-catenin 信号通路异常激活时,会导致放疗耐受。WISP1 Wnt/β-catenin 信号通路下游的应答基因。在ESCC 中,WISP1 通过抑制辐射所致的DNA 损伤,同时激活磷脂酰肌醇激酶(PI3K)来抵抗辐射对癌细胞的杀伤作用。Zhang 研究发现辐射后ESCC 细胞中的BOKAS 表达量增加,进一步研究发现,BOKAS 可促进WISP1 基因的表达,WISP1 又通过不断刺激自身表达,形成一种正反馈循环并增加抗辐射性,患者表现出放疗耐受。

肺腺癌转移相关转录子1metastasis associatedlung adenocarcinomatranscript lMALAT1) 是一个高度保守的lncRNA,其长度为8 779 bp,定位于11q13.1染色体上。Hu 检测发现,在46.3% 食管鳞癌患者尤其是中晚期癌组织中MALAT1 过表达,且其表达量越高,患者临床分期越晚,淋巴结呈远端转移。MALAT1 会抑制ATM-CHK2 信号通路磷酸化,使其诱导的细胞G2/M 期阻滞作用消失,促进ESCC 发展。近期研究发现,MALAT1 可以抑制辐射引起的细胞活力降低及细胞凋亡。MALAT1 是通过上调CKs1cyclin-dependent kinase subunit 1)表达,并由CKs1介导ESCC 细胞抵抗放射杀伤。以上研究提示lncRNA可作为增强放疗效果的潜在治疗靶点。

lncRNA LOC285194 首先被报道于骨肉瘤中,也称为边缘系统相关膜蛋白反义RNA 3limbic systemassociatedmembrane proteinantisense RNA3),其位于人类染色体3q13.31,全长2 105 bp,有4 个外显子。此前已有报道LOC285194 低表达会促进细胞凋亡。Liu 研究发现,LOC285194 序列上同时存在与抑癌因子p53 miR-211 的结合位点,同时受p53 miR-211 的双向调节。与抑癌基因p53 促进LOC285194表达相反,miR-211 LOC285194 表达有抑制作用。抑癌因子p53 具有修复细胞基因损伤的功能,可修复受化疗杀伤的癌细胞。Tong 研究发现,LOC285194低表达的ESCC 患者对放化疗耐受性增加,放化疗对其病症无显著缓解,且无病生存率和总生存率降低,提示LOC285194 可指导ESCC 患者的个体化治疗,同时可作为ESCC 患者的独立预后指标。

在上述研究的基础上, 检测患者血液中这些lncRNA 的表达情况可以作为ESCC 患者是否接受放化疗的选择依据,为揭示lncRNA 放化疗耐受机制提供新的研究思路。

5 结语与展望

本文归纳总结了近几年lncRNA ESCC 发生发展中的相关机制研究报道(见表1)。


由于ESCC发病的隐匿性较强,大多数的ESCC患者被确诊时已属中晚期,常规的治疗手段效果不佳,患者预后不良,开发新的诊断标志物,对于ESCC 患者早期筛查有重要意义。近年来,在ESCC患者血液检测到lncRNA 的报道逐渐增多,lncRNA 作为血液检测指标,具有检测快速、无侵入性等优点,有较大的开发价值及应用前景。

随着基因测序技术的发展,越来越多的研究发现lncRNA ESCC 中存在异常表达,利用lncRNA 作为治疗靶点的研究是当前肿瘤治疗领域的一大热点,虽然相关的具体机制还有待阐明,但lncRNA 在基因调控方面的关键作用,使其成为肿瘤治疗干预的良好选择。随着对lncRNA 研究的不断深入,希望在不久的将来,可以将其应用于ESCC的临床治疗。

 

[ 专家介绍] 

徐寒梅:教授,博士生导师,中国药科大学海洋药学教研室主任。海南省药物研究所顾问,中国生物化学与分子生物学学会海洋生物化学与分子生物学分会理事会理事,江苏省生物化学协会理事。多年从事多肽药物的研究,设计了抗肿瘤多肽安替安吉肽、AP25EDSM 等具有自主知识产权的分子,其中安替安吉肽具有安全性高、动物体内活性显著、不易引发耐药性等优点,现已获得1.1 类化学新药临床批件。近5 年在国内外发表学术文章50 余篇,其中SCI 收录20 篇,主编及参编论著各1 部,主编教材1 部;申请发明专利共28 项(其中国际专利8 项)。近5 年,先后主持了由国家自然科学基金、国家“863”高科技发展计划、国家“重大新药创制”科技重大专项等资助的项目。因与企业合作抗肿瘤多肽研究的卓著成果获得内蒙古自治区“杰出创新引进人才”奖和“草原英才”奖;先后获得江苏省“青蓝工程”优秀骨干教师、中青年学术带头人、南京市领军人才等奖励和称号;被内蒙古自治区政府聘为科技特派员,被教育部“蓝火工程”聘为泰州市科技特派员。


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